(1940年10月至1941年3月)
　　1939年1月，国民党召开的五届五中全会，是它政策上发生重要转变的一次会议。这次会议之后，国民党顽固派在日本诱降和美英劝降之下，破坏国共合作，分裂抗日民族统一战线，其反共活动达到了高潮。在其1939年12月发动的第一次反共高潮被粉碎一年之后，又于1941年1月发动了第二次反共高潮。这次反共活动的重点由华北移到华中，由进攻八路军转向进攻新四军，集中表现就是制造了“皖南事变”。国民党顽固派为配合进攻皖南新四军，伺机向陕甘宁边区发起进攻，妄图一举吃掉边区。1941年初，胡宗南、马步芳、马鸿逵等和三个保安旅、十个保安队共二十万余军队，西起宁夏，南沿泾水，东迄黄河，北经长城，分三个封锁地带、五条封锁线，对边区实行军事包围，并不断制造摩擦，袭击和残杀我八路军战士及地方干部。中国共产党中央和边区政府对国民党顽固派肆意反共、阴谋制造的皖南事变等暴行极为愤慨，并与之进行了针锋相对的斗争。早在皖南事变前，十八集团军朱总司令、彭副总司令就通电全国，揭露国民党枪口对内、进攻陕甘宁边区的阴谋。皖南事变发生后，陕甘宁边区展开了强大的抗议和声援运动。《新中华报》1月19日发表社论：《抗议无法无天的罪行》指出：国军包围袭击皖南新四军“此为自毁军令，自坏国法，自相鱼肉，自损国力之举，实可谓无法无天之至!”这是亲日派顽固分子蓄谋已久的“聚歼计划”，是其实行制造内战破坏抗战，制造分裂破坏团结反共方针的总暴露。社论号召我党我军和全国爱真理论公道的大多数军民同胞团结一致，同顽固派破坏团结和抗战的阴谋和罪行进行坚决的斗争。延安的机关、团体、学校及部队纷纷集会、作诗、发表声明，声讨国民党顽固派制造皖南事变、进攻八路军、封锁陕甘宁边区的种种罪行。边区广大军民的声援运动变成了在边区政府领导下动员人民加强边区建设，加强自卫准备，粉碎国民党封锁，保卫陕甘宁边区，支持新四军、八路军作战的实际行动。
　　中国共产党的正义立场和自卫方针，得到国内，国际舆论的同情和支持。国民党左派领袖宋庆龄、何香凝，国民党中常委柳亚子以及彭泽民等致电国民党中央，斥责蒋介石违背总理遗嘱，破坏联共抗战的行径。电文说：最近政府讨伐共军之事，使中外视听为之一变。这是我痛敌快之事。电函要求蒋介石政府力行吾党国策，撤销剿共部署，坚持联共方针，发展各种抗日力量，停止以武力攻击共产党，停止弹压共产党的一切活动。以表示对我党的支持，同时提出了七项抗战团结主张，要求当局实行。
　　全国抗议运动使蒋介石集团限于空前的孤立。中国共产党反对国民党第二次反共高潮的斗争，“表现了国民党地位的降低和共产党地位的提高，形成了国共力量对比发生某种变化的关键”。这就迫使蒋介石不得不重新估计形势和改变其态度。3月6日，蒋介石在国民参政会二届一次会上表示，保证“以后再亦决无剿共的军事”。8日，中国共产党参政员董必武被选为国民参政会驻会参政员。由于我们党的坚决斗争，加上国民党左派、中间派强烈抗议，国民党顽固派发动的第二次反共高潮，于1941年3月就被彻底粉碎了。
　　毛泽东在《打退第二次反共高潮后的时局》和《关于打退第二次反共高潮的总结》两篇文章中，对于这次斗争的教训以及我党我军在反对顽固派斗争中采取的正确方针和政策作了明确分析。