魏晋南北朝是历史上大分裂、大动荡的时期，统一集权的中央政府已不复存在，不少大族和有文化的士人纷纷迁居河西以避战乱，促使中西交往的孔道河西走廊的文化得到前所未有的提高。五凉王朝的先后建立，也集聚了大批人才。文化水平的提高和大量士人的存在，为本地区接受外来文化提供了知识的基础，也为向中原输送外来文化提供了方便。
　　这一阶段除魏与西晋短时期统一外，尽管国家很不统一，但总的来说丝绸之路乃然发挥着作用，不论是东晋五胡十六国，还是后来的南北朝，都不断有东往西去的使者旅行在丝绸之路上。比如：
　　310年，天竺(印度)僧人佛图澄至洛阳；
　　399年，东晋僧人法显等西行取经；
　　437年，北魏遣董琬、高明等出使西域诸国；
　　468年，北魏遣使韩羊皮出使波斯，与波斯使俱还；
　　518年，宋云与惠生自洛阳出发，西行取经；
　　530年，波斯国遣使南朝。
　　除此之外，还有大量没有留下名字和事迹的使者通由丝绸之路往来于东西方各国。
　　这时中国对西域各地的情况也了解得非常清楚。如关于距离中国很远的罗马帝国，《三国志·乌丸鲜卑东夷传》裴松之注引《魏略·西戌传》说：大秦“国有小城邑合四百余，东西南北数千里。其王治滨侧河海(指今意大利首都罗马城)”。又说大秦多产金、银、铜、铁、神龟、白马、玳瑁、玄熊、玛瑙、象牙、明月珠、夜光珠、真白珠、虎珀、珊瑚、火浣布，以及赤白黑绿黄青绀缥红紫十种流璃等等。“流璃”又作“琉璃”，是一种矿石质的有色半透明体物。由于受波斯人的阻隔，大秦人显然“常利得中国丝，解以为胡绫”。却主要只能“与安息诸国交市于海中”。此外，他们也循海路南下，通过印度与中国西南地区的人民做生意，这就是史书中讲的：“有水道通益州、永昌。故永昌出异物。”④这条路就是由长安至宝鸡，西南入四川，再到今云南省保山县西出国境，经缅甸到印度的“永昌路”。关于丝绸之路的细小发展变化，当时也有记载，如《魏略·西戎传》说：“从敦煌玉门关入西域，前有二道，今有三道。从玉门关西出，经婼羌(新疆若羌县)转西，越葱岭，经县度(即悬度，位于今印度河上)入大月氏，为南道。从玉门关西出，发都护井，回三陇沙北头，经居卢仓，从沙西井转西北，过龙堆(即白龙堆，指玉门关到罗布泊一带的戈壁荒漠，因其被风侵蚀成许多高地和沟壑，婉曲如龙，故名)，到古楼兰，转西诣龟兹，至葱岭，为中道。从玉门关西北出，经横坑，辟三陇沙及龙堆，出五船北，到车师(新疆吐鲁番县西交河古城遗址)界戊己校尉所治高昌(古址位于今吐鲁番东二十余公里的哈拉和卓堡西南，维吾尔语称为“亦都护城”)，转西与中道合龟兹，为新道。”⑤由此可知所谓新道，只是新开辟的原北道的一个分支，仍在天山南麓，而《魏略·西戎传》对它便有这样详尽的叙述，这是经实地考查后才可能得出的结论。
　　政府间的交往，如西晋武帝太康六年(285年)，曾派杨颢出使大宛，谒见了大宛国王蓝庾。蓝庾死后，他的儿子又遣使到晋都洛阳赠汗血马。前秦苻坚建元十四年(378年)，大宛国又曾派人到长安赠送汗血马。
　　由于波斯为集散、中转中国丝绸的主要地区，因而这一时期它是与中国交往最频繁的国家之一。波斯王曾多次派使臣前来北魏的平城(山西省大同市东北)、洛阳(河南省洛阳市)和西魏的长安访问。北魏献文帝拓跋弘，曾派韩羊皮访问波斯首都宿利城(伊拉克巴格达西南)。他回国时，波斯王也派使臣随同回访了平城，并赠送了大象和其他珍贵物品。说明当时中波两国仍然保持着密切的关系，也说明丝绸之路仍然发挥着沟通友谊的作用。
　　两汉时中国文化的西传逐渐扩展，除丝绸外，还有冶铁技术、打井技术。中国在商代已使用陨铁制造兵器，春秋时代开始人工冶铁。汉代，中国出现了低硅灰口铁、快炼铁渗碳钢、铸铁脱碳及生铁炼钢等新工艺、新技术。中国的铁制品沿着丝绸之路传入西方，在汉匈战争中逃亡到西域地区的士卒曾将铸铁技术传给大宛和安息的工匠。大约在公元前2世纪，乌兹别克斯坦境内的费尔干纳人从中国学得了铸铁新技术，然后再传入俄国。在丝绸之路上的中外贸易中，钢铁成为受西域欢迎的商品，安息人就曾努力获取中国的钢铁兵器，使之渐渐流入罗马帝国。
　　丝绸之路有利地促进了中西方的经济文化交流，对促成汉朝的兴盛产生了积极作用。这条丝绸之路，至今仍是中西交往的一条重要通道。在我国当今的对外经济交流中仍然发挥着重大作用。
　　④ 《三国志·魏书·乌丸鲜卑东夷传》裴松之注引《魏略·西戎传》
　　⑤ 《三国志·魏书·乌丸鲜卑东夷传》裴松之注引《魏略·西戎传》